| Levegő mintavétel szedimentációs módszerrel | Mit vizsgálok?
Laboratóriumi levegő
Eszközök, anyagok:
húspepton tápagar lemez, keményítő-kazein tápagar lemet, termosztát
MENETE
1. különböző helyeken elhelyezzük a tápagarlemezeket (Petri-csészében)--> 5, 10, 15 percig fedetlenül hagyjuk
2. expozíciós idő letelte után lezár, feliratoz
3. FEDÉLLEL LEFELÉ 28 fokos termosztátba basszuk, egy hétig ott felejtjük (INKUBÁLÁS)
4. telepszámlálás, telepmorfológiai vizsgálatok
5. összehasonlítjuk a különböző táptalajokat, hogy az mennyire befolyásolta hogy hova raktuk, expozíció idő hatása... |
| Mintavétel felületekről- steril nedves tamponos vizsgálat | Mit vizsgálok?
tárgyakat, felületeket
Mi kell hozzá?
steril, nedves vattatampon, húspepton tápagar
Menete:
1 vizsgálandó felület kb 1 dm2-ét steril nedves vattatamponnal letöröljük
2. inokulált tamponnal szélesztjük a megfelelő tápagar lemezt--> a Petri csészét feliratozzuk (minta típusa, honnan való a minta, mintavétel ideje)
3. fordított helyzetben 28 fokon inkubáció
4. telemorfológia, csíraszámbecslés
5. eltérő felületekről kinőtt telepek összehasonlítása
Mi 4 féle felületről vettünk mintát egy négy részre osztott Petri csészét használva, és azt hasonlítottuk össze |
| Mintavétel felületről- Contact slide (ezt csak beszéltük) | 1. mintavétel előtt ellenőriz: lejárati idő, lemez állapota (ép a csomi, nem beszáradt/fertőzött)--> lemezzáró fóliát egyik saroknál feltépjük ~2cm hosszan--> nyíláson keresztül húzzuk ki a lemezt
2. táptalajos felxilibilis lapocskát az agaros felszínnel a vizsgálandó felületre tesszük és 5 mp-ercig ott tartjuk
3. Az immár fertőzött táptalaj lapocskát az agarral a felszín felé a védőfóliába tesszük, és a csomaghoz tartozó záróelemmel lezárjuk
4. feliratozás
5. 28-fokon termosztát, inkubál 1 hétig
6- kiértékelés |
| Mintavétel személyi tisztaság ellenőrzésére--> ujjlenyomatos | Mit vizsgálunk?
szappanos/fertőtlenítős kézmosás hatékonysága
Mi kell?
szappan, fertőtlenítő, húspepton tápagar, termosztát (csak a szoki)
Menete
1. három részre osztjuk jelöléssel a tápagart
2. kézmosás előtt egyik ujjunkat beleérintjük a táptalajba
3. ugyanazt az ujjat szappanos, madj fertőtlenítős kézmosás után is bele érintjük
4. fertőzött rápagar lemezt LEFELÉ fordítva 28-fokon inkubál 1 hétig a termosztátban
5. telepszámlálás, összehasonlítás, telepmorfológia (kiértékeljük)--> elemezzük a kézmosás hatékonyságát |
| Autokláv használata | Vizsgálat tárgya
tápagar a lombikban
Mi kell?
deszt. víz, cérnakesztyű, autokláv
Menete--> MINDIG FELÜGYELNI KELL!!
1. felnyitjuk az autoklávot és ellenőrizzük, hogy van-e benne elég deszt víz/ ioncserétl víz--> HA NINCS pótol
2. a munkatérbe helyezzük a megfelelően csomagolt sterilizálandó anyagokat (pl.: eszközök, táptalaj)
3. lezárjuk a szórítófejjel az autokláv fedelét
4. ellenőrizzük, hogy a légtelenítőszelep nyitva van-e
5. bekapcsoljuk a fűtését--> jelzőlámpa jelzi ha megindultÍ
6. légtelenítő csapon intenzív gőzkiáramlást észlelünlk (sűrű, tejfehér gőz)--> akkor érte el a 100 fokot--> 4-5 perc várakozás után lezárjuk a légtelenítő szelepet (LÉGTELENÍTÉS)
7. fűtését csak akkor kapcsoljuk ki, ha az adott anyagnak megfelelő hőmérsékleten és nyomáson elegendő időt töltött a sterilizálandó minta (pl.: 1 atm 121 fokon 20 perc)
8. a fűtés megszűntetése után hagyjuk lehűlni 60-70 fokra (megszűnik a túlnyomás)
9. a túlnyomás megszűnése után, a kinyitás előtt ki kell nyitni a légtelenítő szelepet, utána kivehetjük a mintákat |
| Gőzsterilizátor hatásfokának ellenőrzése (ezt is csak beszéltük) | Mit nézek?
GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS ATCC 7953 törzs készítmény életben marad-e?
Menete:
1. spórakészítményt elhelyezzük az autokláv kamraterének megfelelő pontjaira
2. elvégezzük a sterilizálási ciklust
3. ciklust követően egy steril ollóval kivágom a spórákat tartalmazó tasakokat, majd egy steril csipesszel a TS táplevesbe helyezem őket
4. a tápleveseket 55-60!!! fokon 1 hétig inkubáljuk
5. utána megnézem, hogy maradt-e baci/sem |
| Tápagar lemez készítése | 1. összetevők összemérése
2. összemért és olvasztott táptalaj megfelelő pH értékenk beállítása--> indikátor papír/ pH mérővel--> ha kell NaOH vagy HCl adagolásával (1M mindkettőből)
3. vattadugóval és alufóliával lefedjük a lombik száját, autoklávban sterilizáljuk 20 percig 121 fokon
4. ha kényes, akkor sterilizálás után utólagos pH állítás
5. cérnakesztyűs kézzel a még meleg táptalajt össze keverjük a lombikban (lassú, körkös mozgással)--> kivesszük a lezáró dugót és az öntés előtt óvatosan leégetjük a lombik száját Bunsen égő lángjában
6. lemezöntés: a Petri csésze fedelét az egyik oldalon résnyire megemelem, és kb 5 mm vastagon, egyenletesen elolszatva beletöltöm a táptalajt (10 cm-s Petriben ez kb 15-20 ml jelent)
7. a tápagar megszilárdulásáig vízszintesen tartjuk a Petrit, nem mozgatjuk--> feliratozás (típus, készítés dátuma)
8. sterilitási próba (24 órára 28 fokos termosztát)
9. Ha sokáig akarom tárolni, akkor műanyagzacsiba/dobozba teszem, hogy ne száradjon ki |
| Csíraszámbecslés szélesztéses technikával | 1. környezeti mintából steril vízzel 10x léptékű hígítási sorozatot készítünk, a kémcsöveket a hígításnak megfelelően feliratozzuk
2. a sorozat minden tagjából szélesszünk ismert mennyiséget a Petriben lévő tápagar felszínére--> felirazottuk őket
3. fedéllel lefelé inkubál 28 fok 1 hét
4. csíraszámbecslés: megszámoljuk a tápagar lemezeken kifejlődött különálló telepeket, ha több párhuzamos mintánk van, akkor átlagoljuk őket és beszorozzuk a hígítás fokával--> különböző hígítási fokokon kapott telepszámokat mindig az adott hígítási fokkal szorozzuk, ezeket az eredményeket átlagoljuk és egységnyi mennyiségre felírjuk a becsült csíraszám értéket (pl.: 70 telep 10^5-en hígítással--> 70* 10^5 az adott hígítási fokon a becsült csíraszám)
--> mértékegység= TKE/mintatömeg |
| Telepmorfológiai megfigyelések | 1. Tápagar lemezen választunk: 5 különböző és különálló telepet--> lehetőség szerint sötét háttér előtt, áteső fényben vizsgál
SZEMPONTOK:
telep mérete (mm-es átmérő), alakja, elevációja, szegélye, színe, diffúzibilis pigment jelenléte/hiány a telep körül, felülete, denzitása, konzisztenciája (pl.: nyúlós/hártyaszerű v. darabos)
--> rajz a könyvben |
| Izolátum létrehozása ferde táptalajon | 1. kémcső feliratozása: mintára és izolátumra vonatkozó egyedi jelzés, izolálás időpontja
2. oltókacsot ironfogással tartjuk, izzásig hevítjük Bunsen égő lángjában. A táptalajba szúrva hűtjük le, lehetőleg ezzel a telepeket még nem érintve. Hűtött oltókaccsal kiemelünk 1 kacsnyi sejttömeget, majd Petrit lezárjuk
3. oltókacs egyik kézben, steril kémcső a ferde táptalajjal a másik kézben--> oltókacsot tartó kézzel letekered a kémcső fedelét, leveszed, DE NEM TESZED LE
4. kémcső száját Bunsenben leégeted--> cikk cakk vonalban a ferde táptalajra viszede a kacsnyi sejtet, lehetőleg ne érintsük a kémcső száját és belső falát
5. ismét leégetjük a kémcső száját, aztán visszazér
6. oltókacs sterilizálása (ezt tudjuk hogy nem fröcsögtetünk össze vele mindent, nem írom le külön)
7. kémcső, oltókacs megy az álványba
8. tenyészet inkubálása, szoki
9. ink. idő után vizsgálat |
| Tiszta tenyészet létrehozása kevert tenyészetből0 | 1. kémcső: minta neve, tisztítás időpontja
2. oltókacs--> sterilizál--> kémcső száját leéget-->kevert szuszpenzióba merítjük a kacsot--> egy cseppnyi tömeget kiemel--> kémcső szája megint leéget--> cikk cakkban Petrire szélesztés, Petri felületének 1/3-ra--> újra oltókacs égetés, lehűt a táptalajban--> keresztezzük az új oltási vonalat a régivel (ez kb a 2/3-ban van), de nem inokulálod megint, hanem fogod a már meglévőt és onnan kened szét--> 3. harmadon is ugyanez, közte mindig sterilizálód a kacsot
3. inkubálás, szokin
4. utána lesznek egyedülálló telepek is--> ha ezt újra izolálod az a tiszta tenyészet |
| Átoltás (fenntartás) | 1. feliratozás: átoltandó tenyészet jelzése és időpontja
2. 2 kémcsövet egyszerre fogod (átoltandó és üres), kémcsövek szája ne érjen össze és az átoltási felület legyen felül
3. lazítsuk meg a kupakokat, majd az oltókacsot lefertőtlenítjük ( itt is irónfogás van)
4. ezután vesszük le a dugókat (kis, gyűrűs és középső ujjaink közé szorítsuk őket--> semmi ne érjen össze semmivel (se kupakok, se kémcsövek)--> kupakok az átoltás végéig maradjanak a kezünkben
6. leégetjük a kémcsövek száját Bunsen égő lángjában, már steril oltókacspt lehűjtük szokin, átemelünk a tenyészetből egy kacsnyit a ferde táptalaj felszínére (itt is figyelve, hogy a kémcső oldalát és száját ne érinstük), cikk cakk vonal
7. ismét leégetjük a kémcsövek száját, visszazár
8. kacs sterilizál
9. újonnan tenéysztett inkubálás, majd figyelem, hogy nő-e és nem fertőzött, HA NEM: akkor a kifejlődött tenyészetet 4-6 fokon tárolom |
| Hőmérsékleten szaporodás vizsgálata | 1. feliratozzuk a kémcsöveket
2. törzsekből kacsnyit ferde tápagarra oltunk (cikk-cakk)
3. kémcsövek inkubálása 4, 28, 37 fokon egy hétig
4. vizsgálat |
| Eltérő hőtűrés vizsgálata | 1. táptalajokat olvasztunk--> kémcső (arra ráírod a hőmérsékletet, vizsgálandó baci nevét)--> 10-20 perc 60 és 95 fokos vízfürdőben
2. fürdő után 0.1-0.1 ml baci szuszpenziót pipettázunk bele, összekever
3. megint 10 perces hőkezelés a beoltott kémcsövekkel, auzona hőmérsékleten mint előbb
4. hőkezelés után átöntjük steril petribe, ez is feliratoz
5. inkubálás, szoki
6. vizsgálat (kolónia számokat nézem) |
| pH hatása a szaporodásra | 1. feliratozás
2. aszeptikusan pipettázunk szuszpenzióból 0.1-0.1 ml--> 5, 7, 9-es pH-jú táplevesbe, vortexxel összekever
3. inkubálás
4. táplevesek kontrollhoz (steril tápleves) viszonyított zavarosodásánának (optikai denzitás) mértékéből következtethetünk a toleranciára |
| UV hatása a szaporodásra | 1. kacsnyit szuszpendálunk steril vízben, vortexezés
2. 0.1 ml szélesztés a szuszpból tápagar lemezre, egy részét letakarjuk a fertőzött lemeznek--> adott ideig UV alatt exponál, majd leveszem a fóliát
3. petri felirat: baci, UV behatás ideje
4. UV lámpa kikapcsol
5. inkubál
6. vizsgálat |
| Anaerob tenyésztés nátrium-tioglikolát tartalmú magasagarban | 1. kémcső felirat (minta, hígítás foka)
2. mintából steril vízzel 10 hígítás, hígítási sorozat tagjaiból 1-1 ml pipettázás a magasagarba (nátriumos cuccos benne van) (kémcsőben lesznek)
3. inkubál
4. tápközeg belsejében megszámolod a telepeket |
| Antibiotikumok hatása- korong teszt | 1. szuszpenziót készítesz
2. 0.1 szélesztése húspeptonra, felirat
3. steril csipesszel antibiotikum korongok (4-5 korong/lemez)
4. inkubál
5. gátlási zónák vizsgálata--> átmérőket figyeled meg |
| Fitoncidok hatása | 1. Mi nem kifőztük, ahogy tk-ban van a az anyagokat, hanem felvágtunk növényeket (hagyma, fokhagyma, meg illőolajok)
2. szuszpenzió
3. szélesztés lemezen, majd állni hagyjuk és utána sterilizálz dugófúróval lyuk (ha folyadékot töltöttünk), és ebbe a lyukba az illőolaj
4. ami nem folyadék azt frissen vágott felszínükkel tettük a táptalajra
5. inkubálás
6. ez is bele diffundál a talajba és gátlási zóna lesz, ezek átmérője kell |
| Nehézfémionok hatása | 1. szuszpenzió
2. rászélesztjük talajra 0.1, 0.1, felirat
3. hagyjuk szikkadni a táptalajt kicsit, majd lyukfúrás (dugófúróval)--> 3 lyuk/lemez
4. leégett érmét/fémdarabot teszek rá/ CuSO4 szuszp a lyukba eltérő töménységgel
5. inkubál
6. értékel (gátlási zóna, bediffundál, szoki) |
| Egyszerű festés | 1. zsírtalanítás (alkoholba mártom a tárgylemezt és leégetem róla az alkoholt, kb 3x áthúzom a Bunsenen)
2. tlemez felirat
3. szemcseppentővel tlemezre egy csepp víz, ebbe kever kémcsőből baci (szokásos átoltás ferde táptalajról)--> oltókaccsla cirka tlemez 2/3-ra széthúzzuk, megszárítjuk = KENETKÉSZÍTÉS
4. hővel rögzítem--> 3-4 x-er áthúzom Bunsen, úgy hogy ne a bacis fele érjen a lánba (nem a hidegmagba!)
5. rögzített oldatra bázikus festéket cseppentek, 1-2 percig állni hagy, csapvízzel öblít (addig amíg a lefolyó víz színtelen nem lesz)
6. hagyjuk száradni szabad levegőn
7. mikroszkóp: 40-esen kezdek, majd 100-as nagyítás immerziós lencse
8. benzinnel megtisztít ha végeztünk (nem alkohol, mert az károsítja a lencsék ragasztását) |
| Gram festés | 1. Tárgylemez zsírtalanítása
2. Feliratozás.
3. Kenetkészítés.
4. Rögzítés.
5. Festés kristályibolya festékoldattal (1 perc).
6. Öblítés csapvízzel.
7. Kezelés Gram-féle jódoldattal (1 perc).
8. Öblítés csapvízzel.
9. Színtelenítés 96%-os etanollal. (A kenetet szemcseppentő segítségével mindaddig kezeljük alkohollal, amíg a tárgylemezről lecseppenő alkohol szintelen nem lesz.)
10. Öblítés csapvízzel.
11. Kontrasztfestés szafranin festékoldattal (0,5-1 perc).
12. Öblítés csapvízzel.
13. Szárítás.
14. Mikroszkópos értékelés. A Gram-pozitív sejtek kékes-lila, a Gram-negatív sejtek rózsaszínes-piros színűek. |
| Mozgás vizsgálat függőcsepp preparátumban | 1. Készítsünk híg szuszpenziót a vizsgálandó baktériumtenyészetből egy fedőlemez közepén kis csepp vízben, vigyázva arra, hogy a csepp ne folyjon szét.
2. A cseppet fedjük le egy vájt tárgylemezzel úgy, hogy az ne érintse a cseppet.
3. Egyszerre hirtelen mozdulattal fordítsuk meg a két lemezt, ekkor a folyadékcsepp a fedőlemezen függ a tárgylemez vájata felett
4. A preparátum beszáradását megakadályozhatjuk, ha a fedőlemezt a szélén vazparral a tárgylemezhez rögzítjük.
5. Végezzünk fénymikroszkópos megfigyelést, és következtessünk a csillózat típusára. |
