Western blotingas atliekamas taip:

Baltymai išskiriami iš ląstelių ir išgryninami  Baltymai atskiriami naudojant SDS-PAGE  Pradžioje jie ištirpinami detergento natrio dodecilsulfato (sodium dodecyl sulfate) tirpale  Tai denatūruoja baltymą ir apgaubia jį neigiamais jonais  Neigiamai pakrauti baltymai po to yra atskiriami, atliekant elektroforezę poliakrilamido gelyje (polyacrylamide gel electrophoresis)  Po to baltymai perkeliami ant nitroceliuliozės ar nailono filtrų  Filtrai perkeliami į tirpalą, kuriame yra pirminių antikūnų (aptinka tiriamąjį baltymą)  Pridedama antrinio antikūno, atpažįstančio pirminio antikūno tam tikrą sritį  Antrinis antikūnas yra konjuguotas su šarmine fosfataze  Pridedama bespalvio dažo XP  Šarminė fosfatazė verčia dažą į juodos spalvos junginį  Tiriamą baltymą žymi juoda juosta