| Endosimbiozės teorija | Archėjas fagocitavo aproteobakteriją, kuri
evoliucionavo į mitochondriją
– Šios ląstelės ar jų palikuonys
vėliau fagocitavo
cianobakteriją, kuri
evoliucionavo į chloroplastą
– Išorinė organelių membrana
susidarė iš archėjaus
membranos, o vidinė – iš
proteobakterijos ar
cianobakterijos |
| Mitochondrijų kilmė | Endosimbiozinė sąveika, sukūrusi mitochondrijas, įvyko daugiau, nei
prieš 2 milijardus metų.
• Mitochondrijų genomas pasižymi daugeliu ypatybių, būdingų bakterijų
genomams:
– Dauguma mitochondrijų genų, išskyrus esančius mielių mitochindrijų
genome, neturi intronų
– DNR sekų analizė rodo didlelį mitochondrijų giminiškumą αproteobakterijoms, tokioms, kaip Rickettsia prowazekii ir Rhodospirillum
rubrum.
• Daugelis dabar egzistuojančių α-proteobakterijų sudaro simbiozinius ryšius su
eukariotais, pvz., Agrobacterium tumefaciens.
• Mitochondrijų mRNR transliacijos inciciacija naudoja tRNAfMet , kaip ir
bakterijos.
• Mitochondrijų ribosomos panašesnės į prokariotų ribosomas.
– Jos yra jautrios kai kuriems antibiotikams (streptomicinui ir chloramfenikoliui), kurie
blokuoja bakterijų ribosomas, bet ne eukariotų ribosomas.
• Mitochondrijos dauginasi paprasto dalijimosi būdu |
| Chloroplastų
kilmė | Chloroplastai ir
cianobakterijos turi
bendrą protėvį: – Chloroplastų ir
cianobakterijų labai
panaši vidinės
membranos struktūra
– Cianobakterijos, kaip ir
chloroplastai, vykdo
fotosintezę
– Chloroplastų ribosominės
RNR genų sekos labai
panašios į cianobakterijų
rRNR genų sekas |
| Mitochondrijų genomas | Mitochondrijų DNR
(mtDNR) yra išsidėsčiusi
nukleoide
– Paprastai organelėje
aptinkami 1-3 nukleoidai,
kurių kiekviename yra
keletas genomo kopijų
– Nediferencijuotų ląstelių
mitochondrijose yra
didesnis kiekis genomo
kopijų
– Kai kurių pirmuonių
mitochondrijų genomas
yra linijinis |
| Žmogaus mtDNR | Nėra intronų
• Nuo kiekvienos grandinės
transkribuojama viena RNR,
kuri vėliau sukarpoma į
smulkesnes daleles
– 22 tRNR
– 2 rRNR
– 13 mRNR, koduojančių
baltymus, dalyvaujančius
oksidaciniame fosforilinime
• reikia 69 |
| Mitochondrinių genų pernaša į
branduolį | • Daug mitochondrijų genų buvo pernešta į
branduolį
– Greičiausiai atvirkštinė transkriptazė nuo
mitochondrinės mRNR padarydavo DNR
kopiją, kuri integruodavosi į branduolinį
genomą
• Dalis genų buvo tiesiog „pamesti“ kaip
daugiau nereikalingi
Šiuo metu genų pernaša iš mitochondrijų į
branduolį gali vykti tik augaluose, nes
branduolio ir mitochondrijų naudojamas
genetinis kodas sutampa
• Kitose taksonominėse grupėse šis kodas
skiriasi |
| Augalų mitochondrijos | Augalų mitochondrijų genomas yra
didesnis, nei gyvūnų mitochondrijų
• Augalų mitochondrijose vyksta
intensyvi rekombinacija dėl jose
esančių pasikartojančių sekų
• Todėl to paties augalų mitochondrijų
genomai skiriasi
• Paprastai vaizduojami apibendrinti
augalų mitochondrijų genomai, kai
skirtingų mitochondrijų genomai
sujungiami į vieną žiedą
Augalų mitochondrijoms būdingi
intensyvūs genų mainai tiek su
branduoliu, tiek ir su chloroplastais |
| Augalų mitochondrijų
rekombinacija | a) dėl invertuotų pasikartojančių
sekų gali keistis genų tvarka
b) esant dviem tiesioginiams
pasikartojimams, susidaro dvi
skirtingo dydžio molekulės,
mažesnės už nerekombinavusią
molekulę;
c) jei yra daugiau nei du
tiesioginiai pasikartojimai, gali
susidaryti įvairesnės molekulių
kombinacijos |
| Vyriškas citoplazminis sterilumas | Dėl pastovios augalų mitochondrijų rekombinacijos gali
susidaryti chimeriniai genai, trikdantys mitochondrijų
funkcionavimą
• Tai labiausiai paveikia audinius, kuriems reikia didelio kiekio
ATP, pvz., sporogenines ląsteles, iš kurių formuojasi
žiedadulkės
• Išsivysto vyriškas citoplazminis sterilumas – tokio augalo
subręsta kiaušialąstės, bet ne žiedadulkės
• Tokie augalai gali būti naudingi selekcijoje, nes nevyksta jų
savidulka, todėl lengviau atlikti reikalingus kryžminimus
• Gavus reikalingus hibridus, jų fertilumas atstatomas,
kryžminant su augalais, turinčiais genus, neutralizuojančius
CMS |
| Chloroplastų genomas | Dažniausiai skirtingų
rūšių augalų ir dumblių
chloroplastų genomas
(cpDNR) yra labai
panašus
• Kai kurie parazitiniai
augalai, tokie kaip
Epifagus, nebevykdo
fotosintezės
– Jie prarado daugelį
fotosintezės baltymus
koduojančių genų |
| Organelių RNR modifikacijos | Tiek mitochondrijų, tiek chloroplastų
transkriptai gali būti modifikuojami. Vyksta:
– Splaisingas (II grupės)
– Poliadenilinimas
– Trans-splaisingas
– RNA redagavimas |
| Homoplazmija | Ląstelėje yra vieno genotipo organelės |
| Heteroplazmija | – Ląstelėje yra kelių genotipų organelių mišinys
– Atsiranda:
• dėl mutacijų;
• paveldėjimo būdu, kai abu tėvai perduoda savo
organeles dukteriniam organizmui |
| Organelių somatinis išsiskyrimas | Ląstelėms dalijantis, organelės tarp dukterinių
ląstelių pasiskirsto atsitiktinai
• Jei ląstelė heteroplazminė, dukterinės ląstelės
gali būti arba heteroplazminės, arba
homoplazminės
– dažniau susidaro heteroplazminės ląstelės |
| Bendrosios žmogaus mitochondrinių
ligų ypatybės | Paveldimos tik iš motinos
• Heteroplazmija turi įtakos ligos sunkumui
• Atsitiktinis išsiskyrimas ląstelėms dalijantis
turi įtakos ligos sunkumui
• Dažniausiai pažeidžiama nervų sistema
arba raumenys
– Audiniai, kurių energetiniai poreikiai didžiausi |
| Klonavimas | Pagrindiniai žingsniai:
1. DNR išskyrimas ir gryninimas
2. DNR karpymas į fragmentus
3. DNR fragmentų ligavimas
4. Replikacijos pradžios sekų įterpimas,
kad naujai sukurta molekulė galėtų
replikuotis ląstelėje
5. DNR bibliotekos sudarymas |
| DNR karpymas | Naudojamos restrikcijos endonukleazės
• Bakterijų fermentai, atpažįstantys specifinę
nukleotidų seką
– Nukleotidų seka paprastai yra 4-8 bazių ilgio
• Kerpa DNR šiose sekose
• Apsaugo bakterijas nuo virusinių infekcijų
(restrikcijos endonukleazės karpo virusų
DNR, kai jie patenka į bakterinę ląstelę) |
| Antrojo tipo RE | atpažįsta palindromines
sekas ir kerpa DNR specifinėse vietose
• Palindromai - skaitant abiem kryptimis, seka
yra vienoda: |
| RE kirpimo vietų skaičius | Priklauso nuo
– GC ir AT santykio genome ir
– GC ir AT santykio RE atpažinimo vietoje
• Kirpimo tikimybė apskaičiuojama, panaudojus
tikimybių sandaugos taisyklę
– 5’GAATCC3’ (6 bazių atpažinimo vieta)
– Jei GC ir AT santykis analizuojamame genome
yra 50%, tada kirpimo vietų skaičius jame yra
• =1/4 (G) x 1/4 (A) x 1/4 (A) x 1/4 (T) x 1/4 (C) x
1/4 (C)=1/46 = 1 RE kirpimo vieta tenka
maždaug 4096 bazių poroms |
| restrikcijos vietų metilinimas | Bakterijos, produkuojančios RE, turi
apsaugoti savo DNR nuo degradacijos
• Apsauga yra bakterijos DNR esančių
restrikcijos vietų metilinimas
• RE neatpažįsta metilintų restrikcijos
vietų ir jų nekerpa |
| RE kirpimo tipai | RE kerpa DNR ir sukuria dviejų tipų kirpimo vietų
galus
– Bukus galus (nėra 3’ ar 5’ nuosvyrų)
– Lipnius galus (3’ arba 5’ nuosvyros) |
| DNR ligavimas | Klonuojant būtina sujungti DNR fragmentus
(juos liguoti)
• Tinkami fragmentų galai
– Buki galai
• Ligazė yra nespecifinis fermentas, todėl tokiu atveju
gaunama daug atsitiktinai sujungtų fragmentų
– Lipnūs galai su komplementariomis sekomis
– Buki galai su prijungtais linkeriais (trumpos
dirbtinės sekos, turinčios restrikcijos vietas) |
| Vektoriai | Perneša klonuotą svetimą DNR į ląstelę
Pagrindiniai tipai:
• Plazmidės
• Fagas
• Kosmidės
• Bakterijų dirbtinės chromosomos
•
„Shuttle“ vektoriai |
| Pagrindiniai skirtumai tarp įvairių vektorių | • Galimos įklonuoti svetimos DNR
fragmento dydis
• Būdas, kuriuo vektoriai yra įterpiami į
ląstelę
• Replikacijos bakterinėje ląstelėje
mechanizmai |
| Pagrindiniai vektorių panašumai | Turi gebėti replikuotis autonomiškai
• Privalo turėti selektyvų žymenį
• Atsparumas antibiotikams
• b-galaktozidazė |
| Plazmidiniai vektoriai | Žiedinės DNR molekulės
• ori seka
• Kintamas kopijų skaičius ląstelėje
• Daugybinės įklonavimo vietos
• Selektyvūs žymenys
• Inserto dydis: 100-10,000 bp |
| Rekombinantinė plazmidė | Svetima DNR kerpama
su RE
Svetima DNR liguojama
į plazmidę
Plazmidės DNR
kerpama su RE |
| Plazmidės perkėlimas į bakteriją –
transformacija | 1. DNR fragmentų RE karpymas ir ligavimas
2. Liguotų vektorių įterpimas į bakterijų ląsteles
3. Transformuotų ląstelių auginimas terpėje su
antibiotiku
4. DNR insertą turinčių kolonijų atranka,
naudojant X gal (atranka pagal bgalaktozidazės raišką)
5. Reikalingų kolonijų identifikavimas |
| Liambda ( fagas | Bakterijas infekuojantis fagas
• Arba integruojasi į bakterijos chromosomą, arba
nedelsdamas replikuojasi, pasigaminant didesniam
virusinių dalelių kiekiui ir lizuojantis ląstelei
• Į fagą įklonuota DNR gali replikuotis E. coli ląstelėje
• Gali būti įklonuoti didesni DNR fragmentai
• Liambda fago infekcija yra efektyvesnis procesas,
nei transformacija |
| cos | Fagas liambda naudoja cos sekas suformuoti žiedą
arba konkatamerą |
| Konkameris | ilga ištisinė DNR molekulė, kurioje yra kelios tos pačios DNR sekos kopijos, sujungtos nuosekliai. Šios polimerinės molekulės paprastai yra viso genomo, sujungto nuo galo iki galo, kopijos ir atskirtos cos vietomis. |
| Klonavimas į fagą liambdą | 1. Svetima DNR ir fago DNR karpoma su ta pačia RE
2. Išgryninamos kairė ir dešinė fago DNR „rankos“
(turinčios cos seką)
3. Fago DNR liguojama su svetima DNR (fago DNR
bus supakuota į fago galvutę tuo atveju, jei
molekulė bus pakankamai didelė - ~49KB)
4. Naujai suliguota DNR maišoma su fago baltymais,
fagas užkrečia bakterijas |
| Kosmidės | Plazmidės, turinčios fago cos vietą
• Ori
• markeris
• Viena cos vieta |
| Bakterijų dirbtinė chromosoma (BAC) | • Naudojama dideliems fragmentams
konuoti (1000 KB ar didesniems)
• Ori iš F faktoriaus |
| „Shuttle“ vektoriai | Žiedinė plazmidė
• Gali būti naudojama klonuoti genus į E. coli ir
eukariotų (dažniausiai mielių) ląsteles
• Gali būti perkeliamos iš E. coli į mieles ir
priešingai
• Dvi replikacijos pradžios sekos
– E. coli ori
– Eukariotinė ori (dažniausiai mielių) |
| Mielių vektoriai | Mielių 2 mikronų plazmidė
– Natūraliai egzistuoja gamtoje
– Turi vieną replikacijos pradžios seką
• Mielių episominė plazmidė (YEp)
– 2 ori sekos: E coli ir mielių
• Mielių integruojanti plazmidė (YIp)
– Viena ori seka iš E coli
• Mielių centromerinė plazmidė (YCp)
• Mielių dirbtinė chromosoma (YAC) |
| Skirtumai tarp YEp ir YIp | YEp gali būti stabiliai palaikoma mielių
ląstelėse, nes turi mielių ori seką
– Pagal tam tikrus genus susidaro daliniai
diploidai (merodiploidai)
– “Išgelbėja” mutantinį kamieną, jei plazmidėje yra
geno, mutavusio mielių ląstelėje, laukinio tipo
kopija
• YIp gali būti palaikoma mielėse tik tada, jei ji
rekombinavo su mielių chromosoma |
| Genų inaktyvinimas, naudojant YIp vektorių | Rekombinacija su Yip
inaktyvina geną mielių
chromosomoje |
| YCp ir YAC palyginimas | YCp turi replikacijos pradžios seką ir mielių
centromerą
• YAC yra linijiška YCp versija, turinti
telomeras
• Abu vektoriai išsaugomi ląstelėms dalijantis,
nes turi centromeras |
| YAC | A YAC is constructed from the telomeric, centromeric, and replication origin sequences needed for replication in yeast cells. |
| Ti plazmidė | 200 KB bakterinė plazmidė, natūraliai
randama bakterijoje Agrobacterium
tumefaciens (sukeliančioje augalų galus)
• Rekombinantinė plazmidė perkeliama į
bakteriją
• Įvyksta transformacija, kai T-DNR (Ti
plazmidės dalis) integruojasi į augalų
chromosomą.
A. tumefaciens T DNR gali būti panaudojama
kaip vektorius klonuotiems genams į augalą
įterpti
Tačiau pirmiausia reikia modifikuoti Ti
plazmidę
– Genai, sukeliantys auglio augimą, yra pašalinami
– Į T DNR yra įterpiami žymintieji genai, kurių dėka
galima vykdyti transformuotų ląstelių selekciją |
| T-DNR įterpimas į augalų ląsteles | A. tumefaciens neinfekuoja visų rūšių augalus
– Tačiau yra sukurti kiti plazmidės įterpimo metodai
– Biolistinė genų pernaša (t.y., biologinė balistika)
• Antras pagal populiarumą transgeninių augalų kūrimo metodas
• Vartojamas “DNR šautuvas”, kuriuo į ląsteles iššaunamos
mikroprojektilės, padengtos DNR
– Mikroinjekcija
• DNR injekcijoms į ląsteles naudojamas mikroskopinio dydžio
adatos
– Elektroporacija
• Elektros srovė naudojama laikinoms poroms plazminėje
membranoje sukurti; per šias poras į ląstelę gali patekti DNR |
| P elementai kaip DNR
pernašos vektoriai | P elementai yra drozofilos transpozabilūs
elementai
• Gali būti panaudoti transgenų pernašai
• Tam reikia:
– Rekombinantinio P elemento su transgenu ir
selektyviu žymeniu
– P elemento su transpozaze, be terminalinių
pasikartojimų (pagalbinis elementas - helper
element) |
| Virusiniai vektoriai | Kai kurie eukariotų virusai toleruoja svetimą
DNR savo genome
• Kai jie infekuoja eukariotų ląsteles, gali
pernešti svetimą DNR
• Patekę į eukariotų ląstelės vidų, virusai gali:
– Replikuoti savo DNR
– Egzistuoti kaip žiedinė plazmidė
– Integruoti viruso DNR į šeimininko
chromosomą |
| Kai kurios problemos, kylančios su
virusiniais vektoriais | Gali inaktyvinti šeimininko geną
• Jei kita geno kopija įgyja mutaciją, šeimininko
organizme vyks šios mutacijos raiška
• Gali sukelti vėžį (kai kurie virusiniai vektoriai
yra pagaminti iš navikų virusų) |
| SV40 kaip virusinis vektorius | 1. Išskiriama SV40 DNR
2. Svetima DNR klonuojama į SV40
3. Užkrečiamos ląstelės
– Rekombinantinis SV40 replikuojasi,
padedant pagalbiniam virusui
– Rekombinantinis SV40 replikuojasi kaip
plazmidė
– Rekombinantinis SV40 integruojasi į
šeimininko chromosomą |
| Rekombinantinės pelės | Transgeninės pelės
– Į kiaušialąstę įterpiamas transgenas
– Apvaisinta kiaušialąstė implantuojama į
patelės gimdą
– Analizuojama palikuonių DNR
• Nokautinės pelės
– Rekombinacijos būdu endogeninis genas
pakeičiamas transgenu (dažniausiai
inaktyvintu) |
| Transgeninės pelės | Svetima DNR įšvirkščiama į ką tik apvaisintos
kiaušialąstės vyrišką pronukleusą |
| Genų papildymas ir pakeitimas | Genai nebus stabiliai paveldimi, jei nesiintegruos į
šeimininko genomą
Ši integracija vyksta dėl rekombinacijos
Klonuoto geno įterpimas į ląstelę gali sukelti dvi
pasekmes
Genų pakeitimą
Genų papildymą |
| Genų papildymas ir pakeitimas realybe | bakterijose ir mielėse dažniausiai vyksta genų
pakeitimas
Jų genomai yra santykinai maži, todėl ir homologinė
rekombinacija su klonuotu genu vyksta gana dažnai
Sudėtingų eukariotų organizmuose dažniau vyksta
genų papildymas
Jų genomai yra labai dideli, todėl homologinė
rekombinacija su klonuotu genu vyksta retai
Dažnis maždaug 0.1%
Todėl norint sukurti aukštesniuosius eukariotus,
turinčius pakeistus genus, reikia naudoti specialias
metodikas |
| Nokautinės pelės – tikslinio
vektoriaus kūrimas | 1. Kuriamas tikslinis vektorius:
– laukinio tipo geno vidurys yra pakeičiamas
atsparumo neomicinui genu
• inaktyvina laukinio tipo geną
– Taip pat įvedamas tkHSV genas, lemiantis jautrumą
ganciklovirui
2. Vektorius išvirkščiamas į embrionines
kamienines (embryonic stem, ES) ląsteles
3. Ląstelės perkeliamos į terpę, kurioje yra
neomicino ir gancikloviro
– Atrenkamos ląstelės, kuriose įvyko homologinė
rekombinacija |
| Nokautinių pelių kūrimo etapai | 1. Naudojama homologinė rekombinacija
2. Sukuriamas tikslinis vektorius - į nokautą orientuotas
vektorius [knockout (KO) - targeting vector]
3. Vektorius išvirkščiamas į embrionines kamienines
(embryonic stem, ES) ląsteles
4. ES ląstelės, turinčios nokautinį geną, įšvirkščiamos į
pelės blastocistą
5. Blastocistas pernešamas į specialiai paruoštos pelės
gimdą
6. Chimerinėje pelėje pasireikš reporterinis genas
(pvz.,kitokia kailiuko spalva)
7. Chimerinės pelės kryžminamos tarpusavyje
8. Analizuojama palikuonių genominė DNR |
| Vektorių panaudojimas svetimų genų
raiškai | • Reikalingas atitinkamas promotorius
• Reikalingi atitinkami promotoriaus
elementai (kad geno raiška vyktų
teisingame audinyje)
• Reikalingi atitinkami potranskripcinių
modifikacijų signalai
• Reikalingi atitinkami transliacijos
signalai |
| Svetimos DNR pernaša į ląstelę | Transformacija (prokariotuose)
– Bakterijų (pvz., E. coli) ląstelės
paveikiamos taip, kad taptų pralaidesnės
plazmidės DNR
• Cheminė transformacija – ląstelės veikiamos
druska (kalcio chloridu)
• Elektroporacija - E. coli ląstelės paveikiamos
elektros srove
Transfekcija (eukariotuose)
– Poveikis cheminėmis medžiagomis (kalcio
fosfatu)
– Elektroporacija
– Liposomos (membranomis apgaubtos
pūslelės
– Mikroinjekcija
– Biolistinės projektilės |
| Saitspecifinė mutagenezė | Sintetinami oligonukleotidai (17-25 nukleotidų), turintys mutaciją sekos viduryje
2. Oligonukleotidai sumaišomi su denatūruota plazmidžių dvigrandinine DNR, turinčia modifikuojamą geną
3. Oligonukleotidai sudaro bazių poras su plazmidės DNR
4. DNR polimerazė sintetina komplementarią DNR grandinę
5. E. coli transformuojama gauta DNR plazmide |
| transgeniniai | Organizmai, turintys rekombinantinę DNR, integruotą į
savo genomą, yra vadinami transgeniniais |
| Genetiškai modifikuoti organizmai | turi iš kitų rūšių
perkeltus genus, padedančius suteikti organizmui
naujas savybes |
| Rekombinantinė DNR | chimerinė molekulė, sudaryta
iš skirtingų organizmų DNR |
| Transgeninių organizmų panaudojimas | Transgeninių organizmų tyrimai gali suteikti
žinių apie genų funkcijas
Transgeniniai gyvūnai taip naudojami žmogaus
ligų mechanizmams ir gydymo būdams tirti
Transgeniniai organizmai taip pat naudojami
įvairioms kitoms žmogaus reikmėms |
| Svarbiausi GMO poveikio aplinkai
aspektai | Tiesioginis poveikis (invazyvumas,
toksiškumas, atsparumo išsivystymas)
Netiesioginis poveikis (žemės ūkio
technologijų pokyčiai, kenkėjų kontrolės
strategijos pasikeitimai ir kt.) |
| GMO tiesioginis poveikis bioįvairovei | Genų pernaša – iš GMO į laukines rūšis,
susiformuojant hibridams
Invazyvumas (piktžoliškumas) – GM augalų
arba jų hibridų gebėjimas išplisti už pirminių
pasėlių laukų ir tapti piktžolėmis arba
invazyviomis rūšimis kitų rūšių arealuose |
| GMO tiesioginis poveikis ir aplinkai | Patogeninės genetinės medžiagos (pvz., virusinių
vektorių) raiška (ekspresija)
Netikėti reiškiniai, atsirandantys dėl genetinio ir
fenotipinio kintamumo, nelauktų požymių
pasireiškimas dėl genetinės rekombinacijos
Specifinių GMO požymių, žalingų kitiems
organizmams ir pažeidžiančių jų funkciją
ekosistemoje, pasireiškimas |
| Žemės ūkio ir aplinkosaugos įprastinių
veiklų pasikeitimas | Žemės naudojimo pobūdžio pasikeitimas (augalų, atsparių
įvairiems abiotiniams veiksniams – sausrai, druskingumui,
šalnoms, naudojimas išplečia ž.ū. naudmenų ribas; tai gali
turėti tiek teigiamų, tiek neigiamų pasekmių, priklausomai
nuo konkrečios situacijos) |
| Klonuoti organizmai | Yra genetiškai identiški
• Gaunami apvaisintos kiaušialąstės branduolį
pakeičiant epitelinės ląstelės branduoliu
• Mitochondrijų genai lieka iš šeimininko
ląstelės
• Reikia didelio kiekio branduolio persodinimų,
nes procesas nėra efektyvus |
| Genomika | rūšies viso genomo molekulinė
analizė |
| Genomo analizę sudaro dvi pagrindinės fazės | Genolapio sudarymas
Sekvenavimas (nukleotidų sekos nustatymas)
Genomo sekų anotacija
Genomo sekų funkcinė analizė |
| Struktūrinė genomika | prasideda genolapio sudarymu ir
baigiasi pilnu genomo sekvenavimu |
| Funkcinė genomika | tiria, kaip genų sąveikos skuria
organizmo požymius
Funcinės genomikos pagrindinė paskirtis yra išsiaiškinti
genetinių sekų reikšmę organizmo funkcionavimui
Daugeliu atvejų tai leidžia suprasti geno funkciją |
| Southern blotingas | Southern blotingą genų sekų mišinyje
galima aptikti ieškomą geną
Southern blotingas naudojamas:
1. Genų kopijų skaičiui genome nustatyti
2. Aptikti nedidelėms geno delecijoms, kurios nėra
matomos šviesiniu mikroskopu
3. Aptikti genų šeimas
4. Aptikti skirtingų biologinių rūšių homologinius genus
Prieš atliekant Southern blotingą tiriamasis genas
arba jo fragmentas privalo būti klonuotas
Ši klonuota DNR yra pažymima (pvz., radioaktyvia žyme)
ir yra naudojama kaip zondas
Zondas gali aptikti tiriamąjį geną daugelio genų mišinyje |
| Northern blotingas | naudojamas nustatyti specifines
RNR, esančias RNR molekulių mišinyje
Northern blotingas naudojamas:
1. Specifinių genų transkripcijai tam tikrose ląstelėse
aptikti ir palyginti
Nervų ir raumenų ląstelėse
2. Genų transkripcijai palyginti specifinėse vystymosi
etapuose
Embrioninės ir suaugusio individo ląstelės
3. pre-mRNA alternatyviam splaisingui aptikti |
| Western blotingas | naudojamas nustatyti specifinį
baltymą, esantį kitų baltymų mišinyje
Western blotingas naudojamas:
1. Specifiniams baltymas skirtingų tipų ląstelėse aptikti
2. Specifiniams baltymas, susidarantiems skirtingose
organizmo vystymosi stadijose, aptikti |
| Western blotingas atliekamas taip: | Baltymai išskiriami iš ląstelių ir išgryninami
Baltymai atskiriami naudojant SDS-PAGE
Pradžioje jie ištirpinami detergento natrio dodecilsulfato (sodium dodecyl
sulfate) tirpale
Tai denatūruoja baltymą ir apgaubia jį neigiamais jonais
Neigiamai pakrauti baltymai po to yra atskiriami, atliekant elektroforezę
poliakrilamido gelyje (polyacrylamide gel electrophoresis)
Po to baltymai perkeliami ant nitroceliuliozės ar nailono filtrų
Filtrai perkeliami į tirpalą, kuriame yra pirminių antikūnų
(aptinka tiriamąjį baltymą)
Pridedama antrinio antikūno, atpažįstančio pirminio antikūno
tam tikrą sritį
Antrinis antikūnas yra konjuguotas su šarmine fosfataze
Pridedama bespalvio dažo XP
Šarminė fosfatazė verčia dažą į juodos spalvos junginį
Tiriamą baltymą žymi juoda juosta |
| Baltymo sąveikos su DNR
nustatymas | Dažnai tenka tyrinėti baltymų prisijungimą prie
specifinių DNR vietų
Pavyzdžiui, transkripcijos faktorių prisijungimą
Baltymų-DNR sąveikoms tyrinėti naudojami keli
metodai
1. Gelio atsilikimo bandinys (gel retardation assay)
Taip pat vadinama juostų poslinkio bandiniu (band shift assay)
2. DNR pėdų atspaudų metodas (DNA footprinting) |
| Gelio atsilikimo bandinys | paremtas tuo, kad baltymo
prisijungimas prie DNR sulėtina jo judėjimą gelyje
Šis bandinys turi būti atliekamas nedenatūruojančiomis
sąlygomis
Buferis ir gelis neturi sukelti baltymo išsivyniojimo ir atsiskyrimo nuo
DNR spiralės |
| DNR pėdų atspaudas | Metodo esmė yra ta, kad DNR segmentas, prie
kurio yra prisijungęs baltymas, bus apsaugotas nuo
nukleazės DNazės I poveikio |
| Chromatino imunoprecipitacija | Chromatino imunoprecipitacija (ChIP) yra metodas,
leidžiantis nustatyti, ar baltymai gali prisitvirtinti prie
tam tikros DNR srities
Baltymai, prisitvirtinę prie DNR, yra chemiškai
“prisiuvami” prie DNR, paveikus baltymų-DNR kompleksą
formaldehidu
Ląstelės yra lizuojamos ir jų DNR suskaldomos į mažas
dalis
Dominančių baltymų precipitacija (išsodinimas) yra
atliekamas panaudojus antikūnus
DNR yra chemiškai išlaisvinama nuo sąsiuvų su baltymu
DNR yra amplifikuojama panaudojus PGR
DNR seka arba nustatoma tiesiogiai, arba panaudojus
DNR mikrogardelę (“ChIP-on-chip”) |
| polimerazės
grandininė reakcija (PGR) | PGR vykti reikia
1. DNR matricos
Joje yra sritis, kurią reikia amplifikuoti
2. Oligonukleotidų pradmenys
Komplementarūs sekoms, esančioms DNR fragmento, kurį reikia
amplifikuoti, galuose
Tai yra sintetinės maždaug 15-20 nukleotidų ilgio molekulės
3. Dezoksinukleotidų trifosfatai (dNTP)
DNR sintezės pirmtakai
4. Taq polimerazė
DNR polimerazė, išskirta iš bakterijos Thermus aquaticus
Termostabilus fermentas reikalingas todėl, kad PGR metu
reakcijos mišinys yra kaitinamas, todėl kitokios polimerazės būtų
inaktyvinamos |
| AT PGR | PGR taip pat yra naudojama aptikti ir kiekybiškai
įvertinti RNR, esančią gyvose ląstelėse
AT PGR atliekama taip
Iš pavyzdžio išskiriama RNR
Ji sumaišoma su atvirkštine transkriptaze ir pradmeniu,
kuris prisilydys prie tiriamos RNR 3’ galo
Taip yra pagaminama viengrandininė cDNR, kuri gali būti
naudojama kaip matrica paprastai PGR
AT PGR yra itin jautri
Ji gali aptikti net nedidelius RNR kiekius, esančius vienintelėje
ląstelėje |
| VNP aptikimas | 1-as metodas: karpymas S1 nukleaze
2-as metodas: TaqMan genotipavimas |
| DNR bibliotekos | Gali būti dviejų tipų – genominė biblioteka ir
cDNR biblioteka
Genominei bibliotekai sukurti reikia didelių
DNR fragmentų
Naudojamos RE, atpažistančios 8 bp seką
arba atliekama dalinė restrikcija su RE,
atpažistančiomis 4 bp seką
Klonuojama į kosmidę arba BAC vektorių |
| cDNR biblioteka | Išskiriama mRNR
2. Prie mRNR poliA uodegos yra prilydomas oligo
(dT) pradmuo
3. Naudojamas fermentas atvirkštinė transkriptazė,
gebantis sintetinti DNR, naudodamas RNR kaip
matricą
4. Gaunamas DNR-RNR hibridas, kuris veikiamas
RNase H (kerpančia RNR grandinę)
5. DNR polimerazė I pakeičia RNR į DNR
6. DNR ligazė susiuva įkarpas antroje DNR
grandinėje |
| cDNR neturi intronų pasekmės: | Leidžia iš karto tyrinėti tik koduojančias geno sekas
2. Gali vykti koduojamo baltymo raiškabe papildomų
potranskripcinių modifikacijų
Tai ypač svarbu tada, kai šeimininko ląstelės nesugeba vykdyti
splaisingo (pvz., kai eukariotų genas yra klonuojamas į bakterijų
ląsteles) |
| DNR SEKVENAVIMAS | Anksčiau dažniausiai naudotas sekvenavimo
metodas, vadinamas didezoksisekvenavimu
dar kartais vadinamas Sangerio sekvenavimu
Didezoksi metodas remiasi žiniomis apie DNR replikacijos
mechanizmą
DNR polimerazė sujungia du gretimus dezoksinukleotidus, sudarydama
kovalentinę jungtį tarp vieno nukleotido 5’–P galo ir kito nukleotido 3’–
OH galo
Yra žinoma, kad galima susintetinti nukleotidus, neturinčius 3’–OH
grupės |
| grandinės terminacija | Sangeris padarė prielaidą, kad jei prie augančios DNR
grandinės bus prijungiamas didezoksinukleotidas, tokia
grandinė nebegalės toliau ilgėti |
| “Antros kartos” technologijų principai (NGS
– next generation sequencing) | Išskirti DNR
Ją pritvirtinti prie karoliukų ar paviršiaus
DNR sintezės metu generuoti šviesos signalą,
prijungus kiekvieną nukleotidą
Aptikti šviesos signalą mikroskopijos pagalba
Interpretuoti signalų serijas kaip trumpas DNR sekas
Sekos yra 30-300 nukleotidų ilgio
Per vieną analizę galima nuskaityti 0.4 to 1.2 GB
(1,200,000,000 nukleotidų/dieną) nukleotidų sekų
virtines.
Surinkti sekas į genomą |
| „Shotgun“
sekvenavimas | 1. Sukuriama genominė biblioteka
2. Atsitiktinai pasirenkami klonai ir iš abiejų galų nuskaitomos
DNR sekos
3. Kompiuteriu ieškoma sekų, kurių galai persidengia
4. Sekos su persidengiančiais galais yra sujungiamos į vieną
seką
Tokia seka dar yra vadinama kontigu (contig)
Joje yra ištisinis (contiguous) chromosomos regionas, kuris
aptinkamas kaip grupės vektorių persidengiančios sekos |
| Genominės sekos anotavimas | Anotavimas – genų ir juos atitinkančių atviro
skaitymo rėmelių (ORF) nustatymas
– Ieškoma ORF
– ORF viduje tiriamas kodonų nuokrypis
– Nustatomi genų riboženkliai (landmarks):
promotorius,TATA dėžutė, intronų-egzonų
sandūros, poliA sekos
– BLAST analizė, ORF palyginimas su
žinomomis kitų organizmų sekomis
– EST (expressed sequence tag) lokalizavimas |
| EST (expressed sequence tags) | EST atitinka cDNR sekos dalį, geno egzoną
• Dydis 100-300 bp
• Nustatomi sekvenuojant cDNR biblioteką
• EST amplifikacija ir po to atliekama fluorescentinė in situ
hibridizacija gali nustatyti geno padėtį chromosomoje
• Ši padėtis atitinka transkribuojamą geno sritį
• Gali apimti 5‘ ar 3‘ UTR |
| Genų lokalizavimas, naudojant
sekvenavimo duomenis | Kylančios problemos:
• Kai kurių genų raiška vyksta tik
specifiniuose audiniuose ar specifiniu
laiku
• Sunku nustatyti retus genus (mažos
raiškos) cDNR bibliotekoje
• Problemos nustatant genus, kurių
splaisingas yra alternatyvus |
| Evoliucinė genetika | Evoliucinė genetika tyrinėja, kaip genetiniai
procesai veikia ir sukuria biologinę įvairovę
• Pagrindiniai tyrimo lygmenys:
– Molekulinė analizė
– Viso genomo analizė
– Elgsenos ir populiacijų gyvenimo istorijos
tyrimai
– Rūšių palyginamoji analizė |
| Atsitiktinis genų dreifas | atsitiktinis alelių dažnio
pokytis, atsirandantis dėl riboto gametų
pasirinkimo
alelių dažnis gali keistis iš kartos į kartą dėl atsitiktinių
priežasčių
Dėl genų dreifo aleliai gali būti arba fiksuoti
populiacijoje, arba pamesti iš viso
Genų dreifo įtaka alelių dažniui priklauso nuo
populiacijos dydžio |
| Genų dreifas pasižymi dviem svarbiomis
ypatybėmis | 1. Genų dreifas tam tikro alelio dažnio požiūriu
veikia kryptingai
Galiausiai alelis arba fiksuojamas populiacijoje, arba
išeliminuojamas
2. Genų dreifo įtaka didesnė mažose
populiacijose |
| Butelio kaklelio efektas | Gamtoje populiacija gali
labai reikšmingai sumažėti,
pvz., dėl gamtinių
kataklizmų
Tokie kataklizmai
atsitiktinai pašalina
individus nepriklausomai
nuo jų genotipo
Butelio kaklelio periodu,
kai populiacijos dydis yra
labai mažas, gali
pasireikšti genų dreifas |
| Įkūrėjo efektas | Nedidelė individų grupė atsiskiria nuo didesnės
populiacijos ir įkuria koloniją naujoje vietoje
Tai turi dvi svarbias pasekmes
1. Tikėtina, kad įkurtoji populiacija pasižymės mažesniu
genetiniu kintamumu, negu pirminė populiacija
2. Įkurtosios populiacijos alelių dažniai gali žymiai skirtis nuo
pirminės populiacijos |
| genų srautas | Genetine prasme įdomesnis yra genų srautas,
t.y. ne tiek individų migracija, kiek alelių dažnio pokyčiai
Gamtoje individai tarp populiacijų dažniausiai
migruoja abiem kryptimis
Ši dvikryptė migracija turi svarbias pasekmes
1. Ji mažina alelių dažnio skirtumus tarp populiacijų
2. Ji skatina genetinę įvairovę populiacijos viduje |
| Natūraliosios atrankos
pagrindiniai principai | Kitamumas yra būdingas visiems gyviems
organizmams
• Fenotipinis kintamumas yra paveldimas
• Kiekviena organizmų grupė sukuria daugiau
palikuonių, nei yra resursų jiems išgyventi,
todėl tarp palikuonių vyksta konkurencija
• Išgyvenę ir labiau prisitaikę individai paIieka
daugiau palikuonių |
| Natūraliosios atrankos reikšmė
evoliucijai | Natūralioji atranka yra atsakinga už Žemėje
egzistuojančią gyvybės įvairovę
– Įprastinė natūraliosios atrankos pasekmė yra
adaptacijos
– Tačiau adaptacijos negali atsirasti, jei nėra
mutacijų ir genetinio kintamumo
• Evoliucija gali vykti dviem pagrindinėmis
kryptimis: pokyčiai genetinės linijos viduje ir
genetinių linijų išsišakojimas |
| Anagenezė | viena rūšis palaipsniui virsta kita rūšimi |
| Kladogenezė | viena rūšis skyla į dvi naujas rūšis |
| Stazė | laikotarpis, kurio metu rūšys keičiasi tik minimaliai |
| – reprodukcinė izoliacija | Reprodukcinės izoliacijos mechanizmai
apsaugo dviejų subpopuliacijų individus nuo
kryžminimosi
• Du pagrindiniai tipai
–Prezigotinė reprodukcinė izoliacija
–Pozigotinė reprodukcinė izoliacija |
| Prezigotinė reprodukcinė izoliacija | Apsaugo kiaušialąstę nuo apvaisinimo ir
nesusidaro zigota
• Keturi pagrindiniai būdai:
1. Rezidentinė izoliacija
2. Sezoninė izoliacija
3. Etologinė izoliacija
4. Mechaninė izoliacija |
| Pozigotinė reprodukcinė izoliacija | Trukdo palikuonių išgyvenamumui ir
reprodukcijai
• Keturi pagrindiniai būdai:
1. Negyvybingi F1 hibridai
2. Hibridų vystymosi sterilumas
3. Hibridų segregacinis sterilumas
4. Negyvybingi F2 hibridai |
| Alopatrinis rūšių
atsiradimas | Reprodukcinė izoliacija
atsiranda dėl fizinės dviejų
populiacijų atskirties |
| Simpatrinis rūšių
atsiradimas | Reprodukcinė izoliacija
atsiranda dėl genominių
pakitimų arba skirtingos
ekologinės nišos |
| Molekulinė evoliucija | Evoliucinės genetikos tyrimams labai dažnai
panaudojami molekuliniai duomenys
– DNR sekų analizė
– Proteomo analizė
• Analogiškos dviejų rūšių sekos gali būti
palygintos – taip galima nustatyti skaičių
mutacijų, atsiradusių nuo rūšių divergencijos
pradžios |
| Homologai | genai, atsiradę iš vieno protėvinio geno
Homologija yra kokybinė genų ypatybė
– genai yra arba homologiški (t.y., kilę iš bendro protėvio)
arba nehomologiški
• jie negali būti “dalinai homologiški”
• Dviejų genų homologiškumą gali rodyti jų sekų
panašumas |
| ortologai | Jei šie genai randami skirtingose rūšyse |
| paralogai | Jei tokie genai randami toje pačioje rūšyje |
| sintenija | Žmogaus ir pelės genomų palyginimas parodė, kad abiejų
rūšių genomuose genai išsidėstę tais pačiais dideliais
blokais |
| Filogenetinė analizė | Filogenetinė analizė remiasi hipoteze, kad
kuo didesnis yra DNR sekos panašumas,
tuo neseniau šios rūšys turėjo bendrą
protėvį |
| Geno filogenetinis
medis | rodo vieno
homologinio geno
evoliucinius ryšius |
| Rūšies filogenetinis
medis | rodo rūšies
evoliucinius ryšius,
kurie įvertinami tiriant
daugelį genų |
| Neutralumo teorija | Neutralumo teorija teigia, kad dauguma
genetinės įvairovės yra ne dėl atrankos, o
dėl mutacijų ir atsitiktinio genų dreifo
• Didesnė genetinė įvairovė turėtų būti tose
genomo dalyse, kurios yra mažiau
funkciškai svarbios
– Be to, molekulinis kintamumas rūšies viduje
turėtų būti didesnis tuose genuose, kurie yra
mažiau svarbūs organizmo prisitaikomumui |
| Molekulinis laikrodis | Molekulinio laikrodžio idėja remiasi
prielaida, kad neutralios bazių pakaitos
vyksta vienodu greičiu visais evoliucijos
etapais
– Bet skirtingų genų šis greitis yra taip pat
skirtingas
– Genai, koduojantys baltymus, atliekančius
konservatyvias funkcijas, pasižymi žemesniais
neutralių pakaitų dažniaisPagrindiniai žmogaus ir
šimpanzės genomų skirtumai |
| Pagrindiniai žmogaus ir
šimpanzės genomų skirtumai | Skiriasi maždaug 35 milijonai DNR bazių porų (iš
maždaug 3 milijardų, esančių kiekvienos rūšies
genome), taip pat:
– 5 milijonai insercijų/delecijų
– 9 pericentrinės inversijos
– 1 chromosomų susiliejimas
• Dauguma skirtumų yra tose DNR dalyse, kurių
funkcija nėra žinoma; tačiau 3 milijonai skirtumų yra
labai svarbiose koduojančiose genomo dalyse
• Šimpanzės genome nėra daugiau nei 50 genų,
esančių žmogaus genome
• Bet ir žmogaus genome nėra kai kurių genų, kuriuos
turi šimpanzės, pvz., caspase-12 geno, kurio
buvimas apsaugo nuo Alzheimerio ligos |
| haplotipas | Haplotipas yra alelių, esančių tos pačios homologinės
chromosomos daugybiniuose lokusuose, kombinacija.
• Jei homologinėse chromosomose visuose haplotipą lemiančiuose
lokusuose yra tie patys aleliai, chromosomos priklauso tam pačiam
haplotipui
• Jei bent vienas alelis skiriasi, homologinės chromosomos turi
skirtingus haplotipus
– Haplotipų tinklai rodo evoliucinius haplotipų ryšius, kiekvieną
mutaciją pažymėdami vienoje iš šakų |
