Genetika IV
🇬🇧
In English
In English
Practice Known Questions
Stay up to date with your due questions
Complete 5 questions to enable practice
Exams
Exam: Test your skills
Test your skills in exam mode
Learn New Questions
Manual Mode [BETA]
The course owner has not enabled manual mode
Specific modes
Learn with flashcards
Complete the sentence
Listening & SpellingSpelling: Type what you hear
multiple choiceMultiple choice mode
SpeakingAnswer with voice
Speaking & ListeningPractice pronunciation
TypingTyping only mode
Genetika IV - Leaderboard
Genetika IV - Details
Levels:
Questions:
117 questions
| 🇬🇧 | 🇬🇧 |
| Endosimbiozės teorija | Archėjas fagocitavo aproteobakteriją, kuri evoliucionavo į mitochondriją – Šios ląstelės ar jų palikuonys vėliau fagocitavo cianobakteriją, kuri evoliucionavo į chloroplastą – Išorinė organelių membrana susidarė iš archėjaus membranos, o vidinė – iš proteobakterijos ar cianobakterijos |
| Mitochondrijų kilmė | Endosimbiozinė sąveika, sukūrusi mitochondrijas, įvyko daugiau, nei prieš 2 milijardus metų. • Mitochondrijų genomas pasižymi daugeliu ypatybių, būdingų bakterijų genomams: – Dauguma mitochondrijų genų, išskyrus esančius mielių mitochindrijų genome, neturi intronų – DNR sekų analizė rodo didlelį mitochondrijų giminiškumą αproteobakterijoms, tokioms, kaip Rickettsia prowazekii ir Rhodospirillum rubrum. • Daugelis dabar egzistuojančių α-proteobakterijų sudaro simbiozinius ryšius su eukariotais, pvz., Agrobacterium tumefaciens. • Mitochondrijų mRNR transliacijos inciciacija naudoja tRNAfMet , kaip ir bakterijos. • Mitochondrijų ribosomos panašesnės į prokariotų ribosomas. – Jos yra jautrios kai kuriems antibiotikams (streptomicinui ir chloramfenikoliui), kurie blokuoja bakterijų ribosomas, bet ne eukariotų ribosomas. • Mitochondrijos dauginasi paprasto dalijimosi būdu |
| Chloroplastų kilmė | Chloroplastai ir cianobakterijos turi bendrą protėvį: – Chloroplastų ir cianobakterijų labai panaši vidinės membranos struktūra – Cianobakterijos, kaip ir chloroplastai, vykdo fotosintezę – Chloroplastų ribosominės RNR genų sekos labai panašios į cianobakterijų rRNR genų sekas |
| Mitochondrijų genomas | Mitochondrijų DNR (mtDNR) yra išsidėsčiusi nukleoide – Paprastai organelėje aptinkami 1-3 nukleoidai, kurių kiekviename yra keletas genomo kopijų – Nediferencijuotų ląstelių mitochondrijose yra didesnis kiekis genomo kopijų – Kai kurių pirmuonių mitochondrijų genomas yra linijinis |
| Žmogaus mtDNR | Nėra intronų • Nuo kiekvienos grandinės transkribuojama viena RNR, kuri vėliau sukarpoma į smulkesnes daleles – 22 tRNR – 2 rRNR – 13 mRNR, koduojančių baltymus, dalyvaujančius oksidaciniame fosforilinime • reikia 69 |
| Mitochondrinių genų pernaša į branduolį | • Daug mitochondrijų genų buvo pernešta į branduolį – Greičiausiai atvirkštinė transkriptazė nuo mitochondrinės mRNR padarydavo DNR kopiją, kuri integruodavosi į branduolinį genomą • Dalis genų buvo tiesiog „pamesti“ kaip daugiau nereikalingi Šiuo metu genų pernaša iš mitochondrijų į branduolį gali vykti tik augaluose, nes branduolio ir mitochondrijų naudojamas genetinis kodas sutampa • Kitose taksonominėse grupėse šis kodas skiriasi |
| Augalų mitochondrijos | Augalų mitochondrijų genomas yra didesnis, nei gyvūnų mitochondrijų • Augalų mitochondrijose vyksta intensyvi rekombinacija dėl jose esančių pasikartojančių sekų • Todėl to paties augalų mitochondrijų genomai skiriasi • Paprastai vaizduojami apibendrinti augalų mitochondrijų genomai, kai skirtingų mitochondrijų genomai sujungiami į vieną žiedą Augalų mitochondrijoms būdingi intensyvūs genų mainai tiek su branduoliu, tiek ir su chloroplastais |
| Augalų mitochondrijų rekombinacija | A) dėl invertuotų pasikartojančių sekų gali keistis genų tvarka b) esant dviem tiesioginiams pasikartojimams, susidaro dvi skirtingo dydžio molekulės, mažesnės už nerekombinavusią molekulę; c) jei yra daugiau nei du tiesioginiai pasikartojimai, gali susidaryti įvairesnės molekulių kombinacijos |
| Vyriškas citoplazminis sterilumas | Dėl pastovios augalų mitochondrijų rekombinacijos gali susidaryti chimeriniai genai, trikdantys mitochondrijų funkcionavimą • Tai labiausiai paveikia audinius, kuriems reikia didelio kiekio ATP, pvz., sporogenines ląsteles, iš kurių formuojasi žiedadulkės • Išsivysto vyriškas citoplazminis sterilumas – tokio augalo subręsta kiaušialąstės, bet ne žiedadulkės • Tokie augalai gali būti naudingi selekcijoje, nes nevyksta jų savidulka, todėl lengviau atlikti reikalingus kryžminimus • Gavus reikalingus hibridus, jų fertilumas atstatomas, kryžminant su augalais, turinčiais genus, neutralizuojančius CMS |
| Chloroplastų genomas | Dažniausiai skirtingų rūšių augalų ir dumblių chloroplastų genomas (cpDNR) yra labai panašus • Kai kurie parazitiniai augalai, tokie kaip Epifagus, nebevykdo fotosintezės – Jie prarado daugelį fotosintezės baltymus koduojančių genų |
| Organelių RNR modifikacijos | Tiek mitochondrijų, tiek chloroplastų transkriptai gali būti modifikuojami. Vyksta: – Splaisingas (II grupės) – Poliadenilinimas – Trans-splaisingas – RNA redagavimas |
| Homoplazmija | Ląstelėje yra vieno genotipo organelės |
| Heteroplazmija | – Ląstelėje yra kelių genotipų organelių mišinys – Atsiranda: • dėl mutacijų; • paveldėjimo būdu, kai abu tėvai perduoda savo organeles dukteriniam organizmui |
| Organelių somatinis išsiskyrimas | Ląstelėms dalijantis, organelės tarp dukterinių ląstelių pasiskirsto atsitiktinai • Jei ląstelė heteroplazminė, dukterinės ląstelės gali būti arba heteroplazminės, arba homoplazminės – dažniau susidaro heteroplazminės ląstelės |
| Bendrosios žmogaus mitochondrinių ligų ypatybės | Paveldimos tik iš motinos • Heteroplazmija turi įtakos ligos sunkumui • Atsitiktinis išsiskyrimas ląstelėms dalijantis turi įtakos ligos sunkumui • Dažniausiai pažeidžiama nervų sistema arba raumenys – Audiniai, kurių energetiniai poreikiai didžiausi |
| Klonavimas | Pagrindiniai žingsniai: 1. DNR išskyrimas ir gryninimas 2. DNR karpymas į fragmentus 3. DNR fragmentų ligavimas 4. Replikacijos pradžios sekų įterpimas, kad naujai sukurta molekulė galėtų replikuotis ląstelėje 5. DNR bibliotekos sudarymas |
| DNR karpymas | Naudojamos restrikcijos endonukleazės • Bakterijų fermentai, atpažįstantys specifinę nukleotidų seką – Nukleotidų seka paprastai yra 4-8 bazių ilgio • Kerpa DNR šiose sekose • Apsaugo bakterijas nuo virusinių infekcijų (restrikcijos endonukleazės karpo virusų DNR, kai jie patenka į bakterinę ląstelę) |
| Antrojo tipo RE | Atpažįsta palindromines sekas ir kerpa DNR specifinėse vietose • Palindromai - skaitant abiem kryptimis, seka yra vienoda: |
| RE kirpimo vietų skaičius | Priklauso nuo – GC ir AT santykio genome ir – GC ir AT santykio RE atpažinimo vietoje • Kirpimo tikimybė apskaičiuojama, panaudojus tikimybių sandaugos taisyklę – 5’GAATCC3’ (6 bazių atpažinimo vieta) – Jei GC ir AT santykis analizuojamame genome yra 50%, tada kirpimo vietų skaičius jame yra • =1/4 (G) x 1/4 (A) x 1/4 (A) x 1/4 (T) x 1/4 (C) x 1/4 (C)=1/46 = 1 RE kirpimo vieta tenka maždaug 4096 bazių poroms |
| Restrikcijos vietų metilinimas | Bakterijos, produkuojančios RE, turi apsaugoti savo DNR nuo degradacijos • Apsauga yra bakterijos DNR esančių restrikcijos vietų metilinimas • RE neatpažįsta metilintų restrikcijos vietų ir jų nekerpa |
| RE kirpimo tipai | RE kerpa DNR ir sukuria dviejų tipų kirpimo vietų galus – Bukus galus (nėra 3’ ar 5’ nuosvyrų) – Lipnius galus (3’ arba 5’ nuosvyros) |
| DNR ligavimas | Klonuojant būtina sujungti DNR fragmentus (juos liguoti) • Tinkami fragmentų galai – Buki galai • Ligazė yra nespecifinis fermentas, todėl tokiu atveju gaunama daug atsitiktinai sujungtų fragmentų – Lipnūs galai su komplementariomis sekomis – Buki galai su prijungtais linkeriais (trumpos dirbtinės sekos, turinčios restrikcijos vietas) |
| Vektoriai | Perneša klonuotą svetimą DNR į ląstelę Pagrindiniai tipai: • Plazmidės • Fagas • Kosmidės • Bakterijų dirbtinės chromosomos • „Shuttle“ vektoriai |
| Pagrindiniai skirtumai tarp įvairių vektorių | • Galimos įklonuoti svetimos DNR fragmento dydis • Būdas, kuriuo vektoriai yra įterpiami į ląstelę • Replikacijos bakterinėje ląstelėje mechanizmai |
| Pagrindiniai vektorių panašumai | Turi gebėti replikuotis autonomiškai • Privalo turėti selektyvų žymenį • Atsparumas antibiotikams • b-galaktozidazė |
| Plazmidiniai vektoriai | Žiedinės DNR molekulės • ori seka • Kintamas kopijų skaičius ląstelėje • Daugybinės įklonavimo vietos • Selektyvūs žymenys • Inserto dydis: 100-10,000 bp |
| Rekombinantinė plazmidė | Svetima DNR kerpama su RE Svetima DNR liguojama į plazmidę Plazmidės DNR kerpama su RE |
| Plazmidės perkėlimas į bakteriją – transformacija | 1. DNR fragmentų RE karpymas ir ligavimas 2. Liguotų vektorių įterpimas į bakterijų ląsteles 3. Transformuotų ląstelių auginimas terpėje su antibiotiku 4. DNR insertą turinčių kolonijų atranka, naudojant X gal (atranka pagal bgalaktozidazės raišką) 5. Reikalingų kolonijų identifikavimas |
| Liambda ( fagas | Bakterijas infekuojantis fagas • Arba integruojasi į bakterijos chromosomą, arba nedelsdamas replikuojasi, pasigaminant didesniam virusinių dalelių kiekiui ir lizuojantis ląstelei • Į fagą įklonuota DNR gali replikuotis E. coli ląstelėje • Gali būti įklonuoti didesni DNR fragmentai • Liambda fago infekcija yra efektyvesnis procesas, nei transformacija |
| Cos | Fagas liambda naudoja cos sekas suformuoti žiedą arba konkatamerą |
| Konkameris | Ilga ištisinė DNR molekulė, kurioje yra kelios tos pačios DNR sekos kopijos, sujungtos nuosekliai. Šios polimerinės molekulės paprastai yra viso genomo, sujungto nuo galo iki galo, kopijos ir atskirtos cos vietomis. |
| Klonavimas į fagą liambdą | 1. Svetima DNR ir fago DNR karpoma su ta pačia RE 2. Išgryninamos kairė ir dešinė fago DNR „rankos“ (turinčios cos seką) 3. Fago DNR liguojama su svetima DNR (fago DNR bus supakuota į fago galvutę tuo atveju, jei molekulė bus pakankamai didelė - ~49KB) 4. Naujai suliguota DNR maišoma su fago baltymais, fagas užkrečia bakterijas |
| Kosmidės | Plazmidės, turinčios fago cos vietą • Ori • markeris • Viena cos vieta |
| Bakterijų dirbtinė chromosoma (BAC) | • Naudojama dideliems fragmentams konuoti (1000 KB ar didesniems) • Ori iš F faktoriaus |
| „Shuttle“ vektoriai | Žiedinė plazmidė • Gali būti naudojama klonuoti genus į E. coli ir eukariotų (dažniausiai mielių) ląsteles • Gali būti perkeliamos iš E. coli į mieles ir priešingai • Dvi replikacijos pradžios sekos – E. coli ori – Eukariotinė ori (dažniausiai mielių) |
| Mielių vektoriai | Mielių 2 mikronų plazmidė – Natūraliai egzistuoja gamtoje – Turi vieną replikacijos pradžios seką • Mielių episominė plazmidė (YEp) – 2 ori sekos: E coli ir mielių • Mielių integruojanti plazmidė (YIp) – Viena ori seka iš E coli • Mielių centromerinė plazmidė (YCp) • Mielių dirbtinė chromosoma (YAC) |
| Skirtumai tarp YEp ir YIp | YEp gali būti stabiliai palaikoma mielių ląstelėse, nes turi mielių ori seką – Pagal tam tikrus genus susidaro daliniai diploidai (merodiploidai) – “Išgelbėja” mutantinį kamieną, jei plazmidėje yra geno, mutavusio mielių ląstelėje, laukinio tipo kopija • YIp gali būti palaikoma mielėse tik tada, jei ji rekombinavo su mielių chromosoma |
| Genų inaktyvinimas, naudojant YIp vektorių | Rekombinacija su Yip inaktyvina geną mielių chromosomoje |
| YCp ir YAC palyginimas | YCp turi replikacijos pradžios seką ir mielių centromerą • YAC yra linijiška YCp versija, turinti telomeras • Abu vektoriai išsaugomi ląstelėms dalijantis, nes turi centromeras |
| YAC | A YAC is constructed from the telomeric, centromeric, and replication origin sequences needed for replication in yeast cells. |
| Ti plazmidė | 200 KB bakterinė plazmidė, natūraliai randama bakterijoje Agrobacterium tumefaciens (sukeliančioje augalų galus) • Rekombinantinė plazmidė perkeliama į bakteriją • Įvyksta transformacija, kai T-DNR (Ti plazmidės dalis) integruojasi į augalų chromosomą. A. tumefaciens T DNR gali būti panaudojama kaip vektorius klonuotiems genams į augalą įterpti Tačiau pirmiausia reikia modifikuoti Ti plazmidę – Genai, sukeliantys auglio augimą, yra pašalinami – Į T DNR yra įterpiami žymintieji genai, kurių dėka galima vykdyti transformuotų ląstelių selekciją |
| T-DNR įterpimas į augalų ląsteles | A. tumefaciens neinfekuoja visų rūšių augalus – Tačiau yra sukurti kiti plazmidės įterpimo metodai – Biolistinė genų pernaša (t.y., biologinė balistika) • Antras pagal populiarumą transgeninių augalų kūrimo metodas • Vartojamas “DNR šautuvas”, kuriuo į ląsteles iššaunamos mikroprojektilės, padengtos DNR – Mikroinjekcija • DNR injekcijoms į ląsteles naudojamas mikroskopinio dydžio adatos – Elektroporacija • Elektros srovė naudojama laikinoms poroms plazminėje membranoje sukurti; per šias poras į ląstelę gali patekti DNR |
| P elementai kaip DNR pernašos vektoriai | P elementai yra drozofilos transpozabilūs elementai • Gali būti panaudoti transgenų pernašai • Tam reikia: – Rekombinantinio P elemento su transgenu ir selektyviu žymeniu – P elemento su transpozaze, be terminalinių pasikartojimų (pagalbinis elementas - helper element) |
| Virusiniai vektoriai | Kai kurie eukariotų virusai toleruoja svetimą DNR savo genome • Kai jie infekuoja eukariotų ląsteles, gali pernešti svetimą DNR • Patekę į eukariotų ląstelės vidų, virusai gali: – Replikuoti savo DNR – Egzistuoti kaip žiedinė plazmidė – Integruoti viruso DNR į šeimininko chromosomą |
| Kai kurios problemos, kylančios su virusiniais vektoriais | Gali inaktyvinti šeimininko geną • Jei kita geno kopija įgyja mutaciją, šeimininko organizme vyks šios mutacijos raiška • Gali sukelti vėžį (kai kurie virusiniai vektoriai yra pagaminti iš navikų virusų) |
| SV40 kaip virusinis vektorius | 1. Išskiriama SV40 DNR 2. Svetima DNR klonuojama į SV40 3. Užkrečiamos ląstelės – Rekombinantinis SV40 replikuojasi, padedant pagalbiniam virusui – Rekombinantinis SV40 replikuojasi kaip plazmidė – Rekombinantinis SV40 integruojasi į šeimininko chromosomą |
| Rekombinantinės pelės | Transgeninės pelės – Į kiaušialąstę įterpiamas transgenas – Apvaisinta kiaušialąstė implantuojama į patelės gimdą – Analizuojama palikuonių DNR • Nokautinės pelės – Rekombinacijos būdu endogeninis genas pakeičiamas transgenu (dažniausiai inaktyvintu) |
| Transgeninės pelės | Svetima DNR įšvirkščiama į ką tik apvaisintos kiaušialąstės vyrišką pronukleusą |
| Genų papildymas ir pakeitimas | Genai nebus stabiliai paveldimi, jei nesiintegruos į šeimininko genomą Ši integracija vyksta dėl rekombinacijos Klonuoto geno įterpimas į ląstelę gali sukelti dvi pasekmes Genų pakeitimą Genų papildymą |
| Genų papildymas ir pakeitimas realybe | Bakterijose ir mielėse dažniausiai vyksta genų pakeitimas Jų genomai yra santykinai maži, todėl ir homologinė rekombinacija su klonuotu genu vyksta gana dažnai Sudėtingų eukariotų organizmuose dažniau vyksta genų papildymas Jų genomai yra labai dideli, todėl homologinė rekombinacija su klonuotu genu vyksta retai Dažnis maždaug 0.1% Todėl norint sukurti aukštesniuosius eukariotus, turinčius pakeistus genus, reikia naudoti specialias metodikas |
| Nokautinės pelės – tikslinio vektoriaus kūrimas | 1. Kuriamas tikslinis vektorius: – laukinio tipo geno vidurys yra pakeičiamas atsparumo neomicinui genu • inaktyvina laukinio tipo geną – Taip pat įvedamas tkHSV genas, lemiantis jautrumą ganciklovirui 2. Vektorius išvirkščiamas į embrionines kamienines (embryonic stem, ES) ląsteles 3. Ląstelės perkeliamos į terpę, kurioje yra neomicino ir gancikloviro – Atrenkamos ląstelės, kuriose įvyko homologinė rekombinacija |
| Nokautinių pelių kūrimo etapai | 1. Naudojama homologinė rekombinacija 2. Sukuriamas tikslinis vektorius - į nokautą orientuotas vektorius [knockout (KO) - targeting vector] 3. Vektorius išvirkščiamas į embrionines kamienines (embryonic stem, ES) ląsteles 4. ES ląstelės, turinčios nokautinį geną, įšvirkščiamos į pelės blastocistą 5. Blastocistas pernešamas į specialiai paruoštos pelės gimdą 6. Chimerinėje pelėje pasireikš reporterinis genas (pvz.,kitokia kailiuko spalva) 7. Chimerinės pelės kryžminamos tarpusavyje 8. Analizuojama palikuonių genominė DNR |
| Vektorių panaudojimas svetimų genų raiškai | • Reikalingas atitinkamas promotorius • Reikalingi atitinkami promotoriaus elementai (kad geno raiška vyktų teisingame audinyje) • Reikalingi atitinkami potranskripcinių modifikacijų signalai • Reikalingi atitinkami transliacijos signalai |
| Svetimos DNR pernaša į ląstelę | Transformacija (prokariotuose) – Bakterijų (pvz., E. coli) ląstelės paveikiamos taip, kad taptų pralaidesnės plazmidės DNR • Cheminė transformacija – ląstelės veikiamos druska (kalcio chloridu) • Elektroporacija - E. coli ląstelės paveikiamos elektros srove Transfekcija (eukariotuose) – Poveikis cheminėmis medžiagomis (kalcio fosfatu) – Elektroporacija – Liposomos (membranomis apgaubtos pūslelės – Mikroinjekcija – Biolistinės projektilės |
| Saitspecifinė mutagenezė | Sintetinami oligonukleotidai (17-25 nukleotidų), turintys mutaciją sekos viduryje 2. Oligonukleotidai sumaišomi su denatūruota plazmidžių dvigrandinine DNR, turinčia modifikuojamą geną 3. Oligonukleotidai sudaro bazių poras su plazmidės DNR 4. DNR polimerazė sintetina komplementarią DNR grandinę 5. E. coli transformuojama gauta DNR plazmide |
| Transgeniniai | Organizmai, turintys rekombinantinę DNR, integruotą į savo genomą, yra vadinami transgeniniais |
| Genetiškai modifikuoti organizmai | Turi iš kitų rūšių perkeltus genus, padedančius suteikti organizmui naujas savybes |
| Rekombinantinė DNR | Chimerinė molekulė, sudaryta iš skirtingų organizmų DNR |
| Transgeninių organizmų panaudojimas | Transgeninių organizmų tyrimai gali suteikti žinių apie genų funkcijas Transgeniniai gyvūnai taip naudojami žmogaus ligų mechanizmams ir gydymo būdams tirti Transgeniniai organizmai taip pat naudojami įvairioms kitoms žmogaus reikmėms |
| Svarbiausi GMO poveikio aplinkai aspektai | Tiesioginis poveikis (invazyvumas, toksiškumas, atsparumo išsivystymas) Netiesioginis poveikis (žemės ūkio technologijų pokyčiai, kenkėjų kontrolės strategijos pasikeitimai ir kt.) |
| GMO tiesioginis poveikis bioįvairovei | Genų pernaša – iš GMO į laukines rūšis, susiformuojant hibridams Invazyvumas (piktžoliškumas) – GM augalų arba jų hibridų gebėjimas išplisti už pirminių pasėlių laukų ir tapti piktžolėmis arba invazyviomis rūšimis kitų rūšių arealuose |
| GMO tiesioginis poveikis ir aplinkai | Patogeninės genetinės medžiagos (pvz., virusinių vektorių) raiška (ekspresija) Netikėti reiškiniai, atsirandantys dėl genetinio ir fenotipinio kintamumo, nelauktų požymių pasireiškimas dėl genetinės rekombinacijos Specifinių GMO požymių, žalingų kitiems organizmams ir pažeidžiančių jų funkciją ekosistemoje, pasireiškimas |
| Žemės ūkio ir aplinkosaugos įprastinių veiklų pasikeitimas | Žemės naudojimo pobūdžio pasikeitimas (augalų, atsparių įvairiems abiotiniams veiksniams – sausrai, druskingumui, šalnoms, naudojimas išplečia ž.ū. naudmenų ribas; tai gali turėti tiek teigiamų, tiek neigiamų pasekmių, priklausomai nuo konkrečios situacijos) |
| Klonuoti organizmai | Yra genetiškai identiški • Gaunami apvaisintos kiaušialąstės branduolį pakeičiant epitelinės ląstelės branduoliu • Mitochondrijų genai lieka iš šeimininko ląstelės • Reikia didelio kiekio branduolio persodinimų, nes procesas nėra efektyvus |
| Genomika | Rūšies viso genomo molekulinė analizė |
| Genomo analizę sudaro dvi pagrindinės fazės | Genolapio sudarymas Sekvenavimas (nukleotidų sekos nustatymas) Genomo sekų anotacija Genomo sekų funkcinė analizė |
| Struktūrinė genomika | Prasideda genolapio sudarymu ir baigiasi pilnu genomo sekvenavimu |
| Funkcinė genomika | Tiria, kaip genų sąveikos skuria organizmo požymius Funcinės genomikos pagrindinė paskirtis yra išsiaiškinti genetinių sekų reikšmę organizmo funkcionavimui Daugeliu atvejų tai leidžia suprasti geno funkciją |
| Southern blotingas | Southern blotingą genų sekų mišinyje galima aptikti ieškomą geną Southern blotingas naudojamas: 1. Genų kopijų skaičiui genome nustatyti 2. Aptikti nedidelėms geno delecijoms, kurios nėra matomos šviesiniu mikroskopu 3. Aptikti genų šeimas 4. Aptikti skirtingų biologinių rūšių homologinius genus Prieš atliekant Southern blotingą tiriamasis genas arba jo fragmentas privalo būti klonuotas Ši klonuota DNR yra pažymima (pvz., radioaktyvia žyme) ir yra naudojama kaip zondas Zondas gali aptikti tiriamąjį geną daugelio genų mišinyje |
| Northern blotingas | Naudojamas nustatyti specifines RNR, esančias RNR molekulių mišinyje Northern blotingas naudojamas: 1. Specifinių genų transkripcijai tam tikrose ląstelėse aptikti ir palyginti Nervų ir raumenų ląstelėse 2. Genų transkripcijai palyginti specifinėse vystymosi etapuose Embrioninės ir suaugusio individo ląstelės 3. pre-mRNA alternatyviam splaisingui aptikti |
| Western blotingas | Naudojamas nustatyti specifinį baltymą, esantį kitų baltymų mišinyje Western blotingas naudojamas: 1. Specifiniams baltymas skirtingų tipų ląstelėse aptikti 2. Specifiniams baltymas, susidarantiems skirtingose organizmo vystymosi stadijose, aptikti |
| Western blotingas atliekamas taip: | Baltymai išskiriami iš ląstelių ir išgryninami Baltymai atskiriami naudojant SDS-PAGE Pradžioje jie ištirpinami detergento natrio dodecilsulfato (sodium dodecyl sulfate) tirpale Tai denatūruoja baltymą ir apgaubia jį neigiamais jonais Neigiamai pakrauti baltymai po to yra atskiriami, atliekant elektroforezę poliakrilamido gelyje (polyacrylamide gel electrophoresis) Po to baltymai perkeliami ant nitroceliuliozės ar nailono filtrų Filtrai perkeliami į tirpalą, kuriame yra pirminių antikūnų (aptinka tiriamąjį baltymą) Pridedama antrinio antikūno, atpažįstančio pirminio antikūno tam tikrą sritį Antrinis antikūnas yra konjuguotas su šarmine fosfataze Pridedama bespalvio dažo XP Šarminė fosfatazė verčia dažą į juodos spalvos junginį Tiriamą baltymą žymi juoda juosta |
| Baltymo sąveikos su DNR nustatymas | Dažnai tenka tyrinėti baltymų prisijungimą prie specifinių DNR vietų Pavyzdžiui, transkripcijos faktorių prisijungimą Baltymų-DNR sąveikoms tyrinėti naudojami keli metodai 1. Gelio atsilikimo bandinys (gel retardation assay) Taip pat vadinama juostų poslinkio bandiniu (band shift assay) 2. DNR pėdų atspaudų metodas (DNA footprinting) |
| Gelio atsilikimo bandinys | Paremtas tuo, kad baltymo prisijungimas prie DNR sulėtina jo judėjimą gelyje Šis bandinys turi būti atliekamas nedenatūruojančiomis sąlygomis Buferis ir gelis neturi sukelti baltymo išsivyniojimo ir atsiskyrimo nuo DNR spiralės |
| DNR pėdų atspaudas | Metodo esmė yra ta, kad DNR segmentas, prie kurio yra prisijungęs baltymas, bus apsaugotas nuo nukleazės DNazės I poveikio |
| Chromatino imunoprecipitacija | Chromatino imunoprecipitacija (ChIP) yra metodas, leidžiantis nustatyti, ar baltymai gali prisitvirtinti prie tam tikros DNR srities Baltymai, prisitvirtinę prie DNR, yra chemiškai “prisiuvami” prie DNR, paveikus baltymų-DNR kompleksą formaldehidu Ląstelės yra lizuojamos ir jų DNR suskaldomos į mažas dalis Dominančių baltymų precipitacija (išsodinimas) yra atliekamas panaudojus antikūnus DNR yra chemiškai išlaisvinama nuo sąsiuvų su baltymu DNR yra amplifikuojama panaudojus PGR DNR seka arba nustatoma tiesiogiai, arba panaudojus DNR mikrogardelę (“ChIP-on-chip”) |
| Polimerazės grandininė reakcija (PGR) | PGR vykti reikia 1. DNR matricos Joje yra sritis, kurią reikia amplifikuoti 2. Oligonukleotidų pradmenys Komplementarūs sekoms, esančioms DNR fragmento, kurį reikia amplifikuoti, galuose Tai yra sintetinės maždaug 15-20 nukleotidų ilgio molekulės 3. Dezoksinukleotidų trifosfatai (dNTP) DNR sintezės pirmtakai 4. Taq polimerazė DNR polimerazė, išskirta iš bakterijos Thermus aquaticus Termostabilus fermentas reikalingas todėl, kad PGR metu reakcijos mišinys yra kaitinamas, todėl kitokios polimerazės būtų inaktyvinamos |
| AT PGR | PGR taip pat yra naudojama aptikti ir kiekybiškai įvertinti RNR, esančią gyvose ląstelėse AT PGR atliekama taip Iš pavyzdžio išskiriama RNR Ji sumaišoma su atvirkštine transkriptaze ir pradmeniu, kuris prisilydys prie tiriamos RNR 3’ galo Taip yra pagaminama viengrandininė cDNR, kuri gali būti naudojama kaip matrica paprastai PGR AT PGR yra itin jautri Ji gali aptikti net nedidelius RNR kiekius, esančius vienintelėje ląstelėje |
| VNP aptikimas | 1-as metodas: karpymas S1 nukleaze 2-as metodas: TaqMan genotipavimas |
| DNR bibliotekos | Gali būti dviejų tipų – genominė biblioteka ir cDNR biblioteka Genominei bibliotekai sukurti reikia didelių DNR fragmentų Naudojamos RE, atpažistančios 8 bp seką arba atliekama dalinė restrikcija su RE, atpažistančiomis 4 bp seką Klonuojama į kosmidę arba BAC vektorių |
| CDNR biblioteka | Išskiriama mRNR 2. Prie mRNR poliA uodegos yra prilydomas oligo (dT) pradmuo 3. Naudojamas fermentas atvirkštinė transkriptazė, gebantis sintetinti DNR, naudodamas RNR kaip matricą 4. Gaunamas DNR-RNR hibridas, kuris veikiamas RNase H (kerpančia RNR grandinę) 5. DNR polimerazė I pakeičia RNR į DNR 6. DNR ligazė susiuva įkarpas antroje DNR grandinėje |
| CDNR neturi intronų pasekmės: | Leidžia iš karto tyrinėti tik koduojančias geno sekas 2. Gali vykti koduojamo baltymo raiškabe papildomų potranskripcinių modifikacijų Tai ypač svarbu tada, kai šeimininko ląstelės nesugeba vykdyti splaisingo (pvz., kai eukariotų genas yra klonuojamas į bakterijų ląsteles) |
| DNR SEKVENAVIMAS | Anksčiau dažniausiai naudotas sekvenavimo metodas, vadinamas didezoksisekvenavimu dar kartais vadinamas Sangerio sekvenavimu Didezoksi metodas remiasi žiniomis apie DNR replikacijos mechanizmą DNR polimerazė sujungia du gretimus dezoksinukleotidus, sudarydama kovalentinę jungtį tarp vieno nukleotido 5’–P galo ir kito nukleotido 3’– OH galo Yra žinoma, kad galima susintetinti nukleotidus, neturinčius 3’–OH grupės |
| Grandinės terminacija | Sangeris padarė prielaidą, kad jei prie augančios DNR grandinės bus prijungiamas didezoksinukleotidas, tokia grandinė nebegalės toliau ilgėti |
| “Antros kartos” technologijų principai (NGS – next generation sequencing) | Išskirti DNR Ją pritvirtinti prie karoliukų ar paviršiaus DNR sintezės metu generuoti šviesos signalą, prijungus kiekvieną nukleotidą Aptikti šviesos signalą mikroskopijos pagalba Interpretuoti signalų serijas kaip trumpas DNR sekas Sekos yra 30-300 nukleotidų ilgio Per vieną analizę galima nuskaityti 0.4 to 1.2 GB (1,200,000,000 nukleotidų/dieną) nukleotidų sekų virtines. Surinkti sekas į genomą |
| „Shotgun“ sekvenavimas | 1. Sukuriama genominė biblioteka 2. Atsitiktinai pasirenkami klonai ir iš abiejų galų nuskaitomos DNR sekos 3. Kompiuteriu ieškoma sekų, kurių galai persidengia 4. Sekos su persidengiančiais galais yra sujungiamos į vieną seką Tokia seka dar yra vadinama kontigu (contig) Joje yra ištisinis (contiguous) chromosomos regionas, kuris aptinkamas kaip grupės vektorių persidengiančios sekos |
| Genominės sekos anotavimas | Anotavimas – genų ir juos atitinkančių atviro skaitymo rėmelių (ORF) nustatymas – Ieškoma ORF – ORF viduje tiriamas kodonų nuokrypis – Nustatomi genų riboženkliai (landmarks): promotorius,TATA dėžutė, intronų-egzonų sandūros, poliA sekos – BLAST analizė, ORF palyginimas su žinomomis kitų organizmų sekomis – EST (expressed sequence tag) lokalizavimas |
| EST (expressed sequence tags) | EST atitinka cDNR sekos dalį, geno egzoną • Dydis 100-300 bp • Nustatomi sekvenuojant cDNR biblioteką • EST amplifikacija ir po to atliekama fluorescentinė in situ hibridizacija gali nustatyti geno padėtį chromosomoje • Ši padėtis atitinka transkribuojamą geno sritį • Gali apimti 5‘ ar 3‘ UTR |
| Genų lokalizavimas, naudojant sekvenavimo duomenis | Kylančios problemos: • Kai kurių genų raiška vyksta tik specifiniuose audiniuose ar specifiniu laiku • Sunku nustatyti retus genus (mažos raiškos) cDNR bibliotekoje • Problemos nustatant genus, kurių splaisingas yra alternatyvus |
| Evoliucinė genetika | Evoliucinė genetika tyrinėja, kaip genetiniai procesai veikia ir sukuria biologinę įvairovę • Pagrindiniai tyrimo lygmenys: – Molekulinė analizė – Viso genomo analizė – Elgsenos ir populiacijų gyvenimo istorijos tyrimai – Rūšių palyginamoji analizė |
| Atsitiktinis genų dreifas | Atsitiktinis alelių dažnio pokytis, atsirandantis dėl riboto gametų pasirinkimo alelių dažnis gali keistis iš kartos į kartą dėl atsitiktinių priežasčių Dėl genų dreifo aleliai gali būti arba fiksuoti populiacijoje, arba pamesti iš viso Genų dreifo įtaka alelių dažniui priklauso nuo populiacijos dydžio |
| Genų dreifas pasižymi dviem svarbiomis ypatybėmis | 1. Genų dreifas tam tikro alelio dažnio požiūriu veikia kryptingai Galiausiai alelis arba fiksuojamas populiacijoje, arba išeliminuojamas 2. Genų dreifo įtaka didesnė mažose populiacijose |
| Butelio kaklelio efektas | Gamtoje populiacija gali labai reikšmingai sumažėti, pvz., dėl gamtinių kataklizmų Tokie kataklizmai atsitiktinai pašalina individus nepriklausomai nuo jų genotipo Butelio kaklelio periodu, kai populiacijos dydis yra labai mažas, gali pasireikšti genų dreifas |
| Įkūrėjo efektas | Nedidelė individų grupė atsiskiria nuo didesnės populiacijos ir įkuria koloniją naujoje vietoje Tai turi dvi svarbias pasekmes 1. Tikėtina, kad įkurtoji populiacija pasižymės mažesniu genetiniu kintamumu, negu pirminė populiacija 2. Įkurtosios populiacijos alelių dažniai gali žymiai skirtis nuo pirminės populiacijos |
| Genų srautas | Genetine prasme įdomesnis yra genų srautas, t.y. ne tiek individų migracija, kiek alelių dažnio pokyčiai Gamtoje individai tarp populiacijų dažniausiai migruoja abiem kryptimis Ši dvikryptė migracija turi svarbias pasekmes 1. Ji mažina alelių dažnio skirtumus tarp populiacijų 2. Ji skatina genetinę įvairovę populiacijos viduje |
| Natūraliosios atrankos pagrindiniai principai | Kitamumas yra būdingas visiems gyviems organizmams • Fenotipinis kintamumas yra paveldimas • Kiekviena organizmų grupė sukuria daugiau palikuonių, nei yra resursų jiems išgyventi, todėl tarp palikuonių vyksta konkurencija • Išgyvenę ir labiau prisitaikę individai paIieka daugiau palikuonių |
| Natūraliosios atrankos reikšmė evoliucijai | Natūralioji atranka yra atsakinga už Žemėje egzistuojančią gyvybės įvairovę – Įprastinė natūraliosios atrankos pasekmė yra adaptacijos – Tačiau adaptacijos negali atsirasti, jei nėra mutacijų ir genetinio kintamumo • Evoliucija gali vykti dviem pagrindinėmis kryptimis: pokyčiai genetinės linijos viduje ir genetinių linijų išsišakojimas |
| Anagenezė | Viena rūšis palaipsniui virsta kita rūšimi |
| Kladogenezė | Viena rūšis skyla į dvi naujas rūšis |
| Stazė | Laikotarpis, kurio metu rūšys keičiasi tik minimaliai |